TÉCNICAS DE EDICIÓN GENÓMICA

Existen varias técnicas de edición genómica y todas ellas son funcionales y aplicables a la mayoría de enfermedades que padecemos los humanos, dentro de las enfermedades que más muertes causan es la cirrosis hepática y la principal causa de muerte que esta genera se debe a la formación del carcinoma hepatocelular, los científicos han puesto todo su esfuerzo en descifrar las bases moleculares y genéticas de la formación de este cáncer para así contrarrestarlo o dar mejores soluciones terapéuticas.

Así han logrado el descubrimiento de los ARN interferente que provocan el silenciamiento genético, es un proceso biológico en el que moléculas de ARN inhiben la expresión génica al causar la destrucción específica de moléculas de ARN. Dos categorías de moléculas pequeñas de ARN, conocidas como ARN pequeños interferentes -siRNAs y micro-ARNs, que interaccionan con las proteínas llamadas “Argonauta” (AGO), junto a los denominados ARN que interaccionan con PIWI –piRNAs, son cruciales en la RNAi. El silenciamiento genómico que provocan sobre genes celulares cancerigenos como  ZHX1 son cruciales para la disminución de la probabilidad de generar hepatocarcinoma celular.

Referencias Bibliográficas:

1. Terapias Génicas. Disponible en: https://www.uco.es/intergeneracional/index.php/apuntes/finish/44/4136

2. ELSEVIER. Gastroenterología y Hepatología. Biología celular y genética en el cáncer de hígado. Disponible en: http://www.elsevier.es/es-revista-gastroenterologia-hepatologia-14-articulo-biologia-celular-genetica-el-cancer-13107573

TERAPIA CON STEM CELLS EN LA CIRROSIS HEPÁTICA

En la cirrosis hepática se produce fibrogénesis que involucra un estado inflamatorio crónico y a procesos degenerativos producto de la apoptosis y/o necrosis de células parenquimatosas, las MSCs emergen como una alternativa terapéutica para el tratamiento de la cirrosis hepática. Las MSCs tienen la capacidad de migrar y reclutarse con selectividad en tejidos dañados, de promover la reparación de estos tejidos fundamentalmente mediante la secreción de factores tróficos y citoquinas, de diferenciación y de modular el sistema inmunológico.

Las MSCs pueden incorporarse a tejidos dañados, diferenciarse en componentes del tejido conectivo y colaborar en la reparación tisular, MSCs obtenidas de médula ósea, tejido adiposo o cordón umbilical, entre otras fuentes, podrían diferenciarse en células con características similares a hepatocitos mediante protocolos de diferenciación en condiciones in vitro. Estos protocolos consisten en el cultivo de las MSCs durante 7-9 días suplementadas con factor de crecimiento hepatocitario (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos 1 y 4 (FGF1y FGF4), oncostatina M, dexametasona, insulina-transferrina-selenito (ITS), nicotinamida y/o dimetilsulfóxido, o mediante el co-cultivo con hepatocitos. Hepatocitos derivados de las MSCs expresan diversos marcadores característicos de hepatocitos inmaduros, como α-fetoproteína, o maduros, como albúmina, α-1- antitripsina, citoqueratina 18, citocromo P450, factor nuclear 4 alfa de hepatocito1, 26. Estas células se comportan fisiológicamente como hepatocitos, siendo capaces de almacenar glucógeno, metabolizar urea, producir albúmina e incorporar lipoproteínas de baja densidad. 

Referencias Bibliográficas:

1. Fiore E. Células madre mesenquimales y medicina regenerativa en la cirrosis hepática. Actualizado: 10 de enero del 2017, Último acceso: 16 de diciembre del 2017. Disponible en: http://medicinabuenosaires.com/revistas/vol77-17/n2/135-142-Med77-1-6567-Fiore.pdf

DNA RECOMBIANTE

DNA RECOMBIANTE EN LA NATURALEZA

Los ácidos grasos omega-3 son productos del metabolismo secundario, esenciales para el crecimiento. La producción de ácido eicosapentaenoico (EPA, 20: 5ω3) por una nueva especie de bacteria marina Shewanella electrodiphila MAR441T. 

Esta cepa produjo un alto porcentaje (hasta 26%) de ácidos grasos totales y altos rendimientos (mg / g de biomasa) de EPA por debajo de la temperatura óptima de crecimiento. A temperaturas de crecimiento más altas, estos valores disminuyeron enormemente. La cantidad de EPA producida se vio afectada por la fuente de carbono, que también influyó en la composición de ácidos grasos. Esta cepa requirió Na + para el crecimiento y la síntesis de EPA y las células cosechadas a finales de fase estacionaria exponencial o temprana tenían un contenido de EPA más alto. Tanto la mayor cantidad (20 mg g-1) como el mayor porcentaje de EPA (18%) ocurrieron con crecimiento en L-prolina y (NH4) 2SO4. La adición de cerulenina mejoró aún más la producción de EPA a 30 mg g-1. La mutagénesis química utilizando NTG permitió el aislamiento de mutantes con niveles mejorados de contenido de EPA (de 9,7 a 15,8 mg g-1) cuando se cultivaron a 15 ° C. 

DNA RECOMBINANTE ARTIFICIAL EN LA CIRROSIS

La proteína 1 de dedos de cinc y homeoboxes (ZHX1), se localiza en el núcleo de la célula y parece actuar como un represor transcripcional. ZHX1 interactúa con la subunidad α del factor nuclear α (NF-YA), ADN metiltransferasas (DNMT) 3B y ZHX2, todas las cuales están involucradas en la tumorogénesis.Se creo un plásmido recombinante de expresión eucariota que contiene el gen humano ZHX1 (hZHX1) e investigar las actividades biológicas de ZHX1 en el carcinoma hepatocelular que es una afección directa derivada de la cirrosis hepática. Se usó la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para amplificar los fragmentos N y C-terminales (ZHX1-N y ZHX1-C, respectivamente) del gen hZHX1. Los dos fragmentos de PCR se clonaron en el vector pEASY-T1 y se subclonaron en el plásmido pcDNA3 para generar un plásmido pcDNA3-ZHX1 recombinante . 

Después de la identificación por digestión enzimática y secuenciación del ADN , el plásmido recombinante pcDNA3-ZHX1 se transfectó en células SMMC-7721. El nivel de expresión de ZHX1 se detectó mediante RT-PCR y análisis de transferencia Western. Se usaron ensayos de curvas de crecimiento celular para evaluar el efecto de ZHX1 en la proliferación celular. Además, la expresión diferencial de ZHX1 entre el cáncer y el tejido hepático cirrótico adyacente se investigó mediante PCR cuantitativa (qPCR). La digestión enzimática y la secuenciación del ADN confirmaron la construcción exitosa del plásmido recombinante, pcDNA3-ZHX1. qPCR y el análisis de transferencia Western demostraron que ZHX1 se expresó de manera eficiente en células SMMC-7721 y la sobreexpresión de ZHX1 puede inhibir la proliferación de células SMMC-7721. Además, la expresión reducida de ZHX1 está muy extendida entre los tejidos cancerosos de los pacientes con HCC. En conclusión, se construyó con éxito un plásmido de expresión eucariota recombinante , pcDNA3-ZHX1. Además, los resultados actuales indican que una baja expresión de ZHX1 puede ser responsable de la hepatocarcinogénesis derivada de cirrosis hepática.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. PubMed. Construction of a recombinant eukaryotic human ZHX1 gene expression plasmid and the role of ZHX1 in hepatocellular carcinoma.Actualizado: 8 de noviembre del 2013, Último acceso: 4 de diciembre del 2017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24064680

2. PubMed. Enhanced eicosapentaenoic acid production by a new deep-sea marine bacterium Shewanella electrodiphila MAR441T. Actualizado: 8 de noviembre del 2013, Último acceso: 4 de diciembre del 2017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29176835

Southern Blot y Secuenciación de Sanger

Los telómeros son secuencias de ADN repetitivas en los extremos del cromosoma lineal, que protegen los cromosomas contra la fusión y el daño de extremo a extremo, proporcionando estabilidad cromosómica. Las mutaciones con pérdida de función en los genes de mantenimiento de los telómeros son factores de riesgo genéticos para el desarrollo de cirrosis.

Se examino si las mutaciones de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros se asociaron con el carcinoma hepatocelular (HCC) secundario a la cirrosis. La longitud de los telómeros de leucocitos de sangre periférica se midió mediante Southern blot, para las variantes del gen de la telomerasa (enTERT y TERC ) por secuenciación de Sanger.

Se encontraron variantes constitucionales que producen cambios de aminoácidos en la transcriptasa inversa de la telomerasa en una pequeña proporción de pacientes con hepatocarcinoma celular asociado a la cirrosis.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:

1. Pubmed. Biología telomérica y mutaciones de telomerasa en pacientes cirróticos con carcinoma hepatocelular. Actualizado: 16 de Agosto del 2017, Último acceso: 3 de diciembre del 2017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5558955/

PRUEBAS DE PCR

Estudios recientes han identificado que la expresión del receptor LAIR-1 en las células gigantes del hígado (macrófagos), tienen implicaciones en el desarrollo de cirrosis hepática, además de estar implicado en alteraciones del factor de crecimiento TGF-B1.

Las tipo de PCR que son utilizadas son la qRTPCR y la PCR-AMP , esta buscan analizar los polimorfismos de TGF B1 en la cirrosis buscando en genotipos de 3 diferentes polimorfismos (dos en el gen COLIA1 y uno en el COLIA2), mediante la amplificación de las regiones correspondientes por PCR. Para esto se usa una muestra de sangre donde buscamos macrófagos derivados de monocitos (M-DM),  peritoneales del líquido ascítico y (M-DM) de sangre periférica.

Entre los principales tipos de ácidos nucleicos que se analizaran son: ARN viral----RT---- ADNc, la extracción de losmismo se realiza con un Kit comercial normal

Extracción de acido nucleico:

Lisis                                  kit RNeasyMini kity        

Separación                      kit” Superscript II                          

Purificación                     Reverse Transcriptase”                    

GEN a amplificar: LAIR-1ª y LAIR-1b

TGFB1

TIPO DE PCR: qRTPCR - PCR-AMP

PASOS:

D- 95º por 5 min 35 ciclos

H- 64-45s

E- 72º por 1 min

VISUALIZACIÓN: EFO - Electroforesis

1.- Simplicidad y rapidez: El tiempo de realización del diagnóstico va a depender en gran medida del método empleado en la extracción de ADN a partir de las muestras clínicas. En los casos más sencillos, el resultado final del diagnóstico de varias muestras clínicas puede obtenerse al cabo de las 3 a 6 horas tras su recepción en el laboratorio, sin la necesidad de aislamiento previo del agente.

2.- Especificidad: La especificidad de la reacción de PCR está condicionada por el carácter restrictivo del fragmento de ADN a amplificar entre las estirpes de una misma especie, entre las especies de un mismo género y entre un grupo de microorganismos filogenéticamente relacionados.

3.- Sensibilidad: Una de las ventajas de la PCR es que tanto la cantidad como la calidad del ADN a amplificar, no necesitan ser muy altas. El ADN extraído a partir de una única célula, puede ser suficiente para una buena reacción de amplificación.

4.- Alternativas a la detección tradicional: desde el punto de vista del diagnóstico, la distinción entre microorganismos muertos y vivos puede ser de especial importancia en el control de algunas enfermedades infecciosas.

5.- Los ensayos moleculares, son altamente específicos debido a que detectan la secuencia genética única del patógeno buscado. Incluso se pueden distinguir variedades de patógenos de la misma especie.

BIBLIOGRAFÍA:

1. PubMed. Leukocyte associated immunoglobulin like receptor 1. Actualizado: 5 de noviembre del 2017, Último acceso: 26/11/2017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/39032. Duque-Jaramillo A,  Julio C Rendón, Fabián Cortés-Mancera, Correa G, Restrepo JC, Hoyos S, Navas MC. Infección oculta por el virus de la hepatitis B en pacientes sometidos a trasplante hepático/ Occult Hepatitis B Virus Infection in Liver Transplant Patients. SciELO. Actualizado: 21 de mayo del 2016, Último acceso: 26/11/2017. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-99572016000400004&script=sci_abstract&tlng=es 

PRUEBAS DE TAMIZAJE Y DIAGNÓSTICO

Las pruebas de tamizaje que nos sirven para empezar a sospechar de una cirrosis hepática son:

*Examen físico: Nos permite identificar un crecimiento anormal del hígado (Hepatomegalia), lo que nos sirve como indicio pero no presisamente nos afirma que padezca de cirrosis ya que esta anormalidad se asocia con otras patologías.

*Tiempo de Protrombina: Ya que el hígado sirve en la síntesis de varios factores de la coagulación, esté al tener comprometido por el daño celular, no logra generar una suficiente cantidad, por lo que el tiempo de protrombina estará aumentado.

*Pruebas Imageneológicas: Tenemos un grupo variado de pruebas, las cuales incluyen, tomografía axial computarizada, resonancia magnética, ultrasonido abdominal y los rayos X, el funcionamiento de estas pruebas es la emisión de radiaciones ionizantes para producir imágenes, las mismas que nos indican la magnitud del daño y nos permiten identificar signos de la cirrosis como son: ascitis, hepatoesplenomegalia, trombosis de la vena hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo este tipo de pruebas no son confirmatorias pero si son de gran utilidad para el diagnostico definitivo de la enfermedad.

*Pruebas serológicas: En el hígado podemos encontrar un sin numero de biomarcadores, entre los más importantes que tenemos son: los dos tipos de Aminotransferasas (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa) que tienen una especificidad del 95-100% pero una sensibilidad del 45-75%, además tenemos la gamma glutamil transferasa, son de mucha utilidad pero debido a que se pueden expresar en otro tipo de órganos hacen muy dificil la determinación de la enfermedad que estamos tratando de detectar.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS

*Transductor de señal y el activador de transcripción STAT3: Estudios recientes afirman que el alto nivel de expresión de este transductor de señal, son claves en la identificación de la cirrosis hepática ya que este se encuentra sobreexpresado y sirve también para ver la predisposición de la persona a generar un hepatocarcinoma celular. Está prueba a resultado ser muy efectiva ya que tiene una sensibilidad del 96% y una especificidad del 95%, además tiene mayor validez si se la realiza en conjunto con una prueba de alfa-feto proteína.

*Biopsia Hepática: En esta prueba se extrae mediante equipos no invasivos un fragmento de tejido de hígado, el cual se somete a varias pruebas, inmunológicas, histológicas, etc para la confirmación de la enfermedad.

Referencias Bibliográficas:

1. Susana P. Hipertransaminasemias. Actualizado: 13 de septiembre del 2013, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: https://magllerandi.files.wordpress.com/2013/10/hipertrasnsaminasemias.pdf

2. Hígado Sano. Tomografía abdominal en pacientes con cirrosis por alcohol. Actualizado: 23 de diciembre del 2015, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: http://www.higadosano.com/tomografia-abdominal-en-pacientes-con-cirrosis-por-alcohol/

3. CCM Salud. INR o Tiempo de Protrombina. Actualizado: 21 de agosto del 2014, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: http://salud.ccm.net/faq/19713-inr-o-tiempo-de-protombina

4. Versión para profesionales. Pruebas de laboratorio para el hígado y la vesícula biliar. Actualizado: 25 de marzo del 2015, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: https://www.msdmanuals.com/es/professional/trastornos-hep%C3%A1ticos-y-biliares/pruebas-para-trastornos-hep%C3%A1ticos-y-biliares/pruebas-de-laboratorio-para-el-h%C3%ADgado-y-la-ves%C3%ADcula-biliar

5. Chinese Medical Journal. Transductor de señal y activador de la transcripción 3 para la diferenciación del carcinoma hepatocelular de la cirrosis. Actualizado: 10 de noviembre del 2017, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: http://www.cmj.org/article.asp?issn=0366-6999;year=2017;volume=130;issue=22;spage=2686;epage=2690;aulast=Li