PRUEBAS DE PCR

Estudios recientes han identificado que la expresión del receptor LAIR-1 en las células gigantes del hígado (macrófagos), tienen implicaciones en el desarrollo de cirrosis hepática, además de estar implicado en alteraciones del factor de crecimiento TGF-B1.

Las tipo de PCR que son utilizadas son la qRTPCR y la PCR-AMP , esta buscan analizar los polimorfismos de TGF B1 en la cirrosis buscando en genotipos de 3 diferentes polimorfismos (dos en el gen COLIA1 y uno en el COLIA2), mediante la amplificación de las regiones correspondientes por PCR. Para esto se usa una muestra de sangre donde buscamos macrófagos derivados de monocitos (M-DM),  peritoneales del líquido ascítico y (M-DM) de sangre periférica.

Entre los principales tipos de ácidos nucleicos que se analizaran son: ARN viral----RT---- ADNc, la extracción de losmismo se realiza con un Kit comercial normal

Extracción de acido nucleico:

Lisis                                  kit RNeasyMini kity        

Separación                      kit” Superscript II                          

Purificación                     Reverse Transcriptase”                    

GEN a amplificar: LAIR-1ª y LAIR-1b

TGFB1

TIPO DE PCR: qRTPCR - PCR-AMP

PASOS:

D- 95º por 5 min 35 ciclos

H- 64-45s

E- 72º por 1 min

VISUALIZACIÓN: EFO - Electroforesis

1.- Simplicidad y rapidez: El tiempo de realización del diagnóstico va a depender en gran medida del método empleado en la extracción de ADN a partir de las muestras clínicas. En los casos más sencillos, el resultado final del diagnóstico de varias muestras clínicas puede obtenerse al cabo de las 3 a 6 horas tras su recepción en el laboratorio, sin la necesidad de aislamiento previo del agente.

2.- Especificidad: La especificidad de la reacción de PCR está condicionada por el carácter restrictivo del fragmento de ADN a amplificar entre las estirpes de una misma especie, entre las especies de un mismo género y entre un grupo de microorganismos filogenéticamente relacionados.

3.- Sensibilidad: Una de las ventajas de la PCR es que tanto la cantidad como la calidad del ADN a amplificar, no necesitan ser muy altas. El ADN extraído a partir de una única célula, puede ser suficiente para una buena reacción de amplificación.

4.- Alternativas a la detección tradicional: desde el punto de vista del diagnóstico, la distinción entre microorganismos muertos y vivos puede ser de especial importancia en el control de algunas enfermedades infecciosas.

5.- Los ensayos moleculares, son altamente específicos debido a que detectan la secuencia genética única del patógeno buscado. Incluso se pueden distinguir variedades de patógenos de la misma especie.

BIBLIOGRAFÍA:

1. PubMed. Leukocyte associated immunoglobulin like receptor 1. Actualizado: 5 de noviembre del 2017, Último acceso: 26/11/2017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/39032. Duque-Jaramillo A,  Julio C Rendón, Fabián Cortés-Mancera, Correa G, Restrepo JC, Hoyos S, Navas MC. Infección oculta por el virus de la hepatitis B en pacientes sometidos a trasplante hepático/ Occult Hepatitis B Virus Infection in Liver Transplant Patients. SciELO. Actualizado: 21 de mayo del 2016, Último acceso: 26/11/2017. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-99572016000400004&script=sci_abstract&tlng=es 

PRUEBAS DE TAMIZAJE Y DIAGNÓSTICO

Las pruebas de tamizaje que nos sirven para empezar a sospechar de una cirrosis hepática son:

*Examen físico: Nos permite identificar un crecimiento anormal del hígado (Hepatomegalia), lo que nos sirve como indicio pero no presisamente nos afirma que padezca de cirrosis ya que esta anormalidad se asocia con otras patologías.

*Tiempo de Protrombina: Ya que el hígado sirve en la síntesis de varios factores de la coagulación, esté al tener comprometido por el daño celular, no logra generar una suficiente cantidad, por lo que el tiempo de protrombina estará aumentado.

*Pruebas Imageneológicas: Tenemos un grupo variado de pruebas, las cuales incluyen, tomografía axial computarizada, resonancia magnética, ultrasonido abdominal y los rayos X, el funcionamiento de estas pruebas es la emisión de radiaciones ionizantes para producir imágenes, las mismas que nos indican la magnitud del daño y nos permiten identificar signos de la cirrosis como son: ascitis, hepatoesplenomegalia, trombosis de la vena hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo este tipo de pruebas no son confirmatorias pero si son de gran utilidad para el diagnostico definitivo de la enfermedad.

*Pruebas serológicas: En el hígado podemos encontrar un sin numero de biomarcadores, entre los más importantes que tenemos son: los dos tipos de Aminotransferasas (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa) que tienen una especificidad del 95-100% pero una sensibilidad del 45-75%, además tenemos la gamma glutamil transferasa, son de mucha utilidad pero debido a que se pueden expresar en otro tipo de órganos hacen muy dificil la determinación de la enfermedad que estamos tratando de detectar.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS

*Transductor de señal y el activador de transcripción STAT3: Estudios recientes afirman que el alto nivel de expresión de este transductor de señal, son claves en la identificación de la cirrosis hepática ya que este se encuentra sobreexpresado y sirve también para ver la predisposición de la persona a generar un hepatocarcinoma celular. Está prueba a resultado ser muy efectiva ya que tiene una sensibilidad del 96% y una especificidad del 95%, además tiene mayor validez si se la realiza en conjunto con una prueba de alfa-feto proteína.

*Biopsia Hepática: En esta prueba se extrae mediante equipos no invasivos un fragmento de tejido de hígado, el cual se somete a varias pruebas, inmunológicas, histológicas, etc para la confirmación de la enfermedad.

Referencias Bibliográficas:

1. Susana P. Hipertransaminasemias. Actualizado: 13 de septiembre del 2013, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: https://magllerandi.files.wordpress.com/2013/10/hipertrasnsaminasemias.pdf

2. Hígado Sano. Tomografía abdominal en pacientes con cirrosis por alcohol. Actualizado: 23 de diciembre del 2015, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: http://www.higadosano.com/tomografia-abdominal-en-pacientes-con-cirrosis-por-alcohol/

3. CCM Salud. INR o Tiempo de Protrombina. Actualizado: 21 de agosto del 2014, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: http://salud.ccm.net/faq/19713-inr-o-tiempo-de-protombina

4. Versión para profesionales. Pruebas de laboratorio para el hígado y la vesícula biliar. Actualizado: 25 de marzo del 2015, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: https://www.msdmanuals.com/es/professional/trastornos-hep%C3%A1ticos-y-biliares/pruebas-para-trastornos-hep%C3%A1ticos-y-biliares/pruebas-de-laboratorio-para-el-h%C3%ADgado-y-la-ves%C3%ADcula-biliar

5. Chinese Medical Journal. Transductor de señal y activador de la transcripción 3 para la diferenciación del carcinoma hepatocelular de la cirrosis. Actualizado: 10 de noviembre del 2017, (Último acceso: 17/11/2017). Disponible en: http://www.cmj.org/article.asp?issn=0366-6999;year=2017;volume=130;issue=22;spage=2686;epage=2690;aulast=Li

ALTERACIÓN EPIGENÓMICA EN LA CIRROSIS HEPÁTICA

La inflamación crónica y la fibrosis en la cirrosis hepática crean un micro-ambiente propicio para una regulación epigenética inadecuada pudiendo generar está el desarrollo de cáncer, el mismo que produce metástasis de forma más rápida y consecuentemente las probabilidades de muerte son mayores. Los niveles altos de expresión de G9a se correlacionan con una mayor metilación de la Lisina 9 de la Histona H3 produciendo mono y dimetilación, estos a su vez mediante la unión al complejoPRC1, genera represión transcripcional en la región de la heterocormatina, provocando una diferenciación celular errónea.

Está histona metiltranferasaG9a se une a la región promotora del gen RARRES3, lo que provoca una metilación de la Lisina 9 de Histona H3.

Todo este proceso regula negativamente la expresión del gen supresor de tumor RARRES3, provocando que este gen no pueda promover la muerte celular de células cancerígenas ya que se inhibe su capacidad de reducir el crecimiento tumoral y la metástasis.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Frontiers in Immonology. Papel funcional de la Histona Metiltranseferasa G9a en el cáncer. Actualizado: 25 de septiembre del 2015, Último acceso: 11/11/2017. Disponible en: https://translate.google.com.ec/translate?hl=es-419&sl=en&u=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4585248/&prev=search 

2. Genética Médica. Epigenética. Actualizado: 06 de julio del 2016, Último acceso: 11/11/2017. Disponible en: https://revistageneticamedica.com/epigenetica/
3. JANO. Un tipo de alteración epigenética hace que el cáncer de hígado crezca. Actualizado: 28 de noviembre del 2016, Último acceso: 11/11/2017. Disponible en: http://www.jano.es/noticia-un-tipo-alteracion-epigenetica-que-26740

DEFECTOS MOLECULARES EN LA TRADUCCIÓN

Un problema derivado de la cirrosis hepática, son las hiperbilirrubinemias no conjugadas, estas se deben a defectos de los genes que codifican el complejo enzimático de las UDP-glucuronosil-transferasas (UGTs). Se debe principalmente a alteraciones en los dos genes (UGT1 y UGT2) que codifican la información necesaria para la síntesis de dos tipos de UGTs, los mismos que por variantes menores en la transcripción de sus exones, determinan la síntesis de varias isoformas de esta enzima con diferencias en su actividad catalítica y en la afinidad por los sustratos.

Las enzimas de la familia UGT1 se encargan de la glucuronidación de la billirubina, cuando hay una mutación en la región del promotor del gen UGT1, generan una proteína con una estructura y síntesis normal pero cuya expresión y actividad enzimática están reducidas significativamente, dando origen al Síndrome de Gilbert.

Cuando la mutación en el gen UGT1 ocurre en la zona codificante (exones), altera la estructura o impide la expresión de la proteína, por lo que la actividad de la enzima esta disminuida o ausente, dando origen al Síndrome de Crigler-Najjar (SNC) que se caracteriza por el depósito de bilirubina en el sistema nervioso central.

Referencias Bibliográficas:

1. Concepciòn G. Fibrisis Hepática. Transplante de Hígado. Actualizado el 15 de octubre del 2014, (Último acceso: 2/11/2017). Disponible en: http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=90224321&pident_usuario=0&pcontactid=&pident_revista=288&ty=104&accion=L&origen=gastromexico%20&web=www.revistagastroenterologiamexico.org/&lan=es&fichero=08vol68nums2.pdf

2. Marcela M. Alcohol, cirrosis y predisposición genética. Actualizado el: 26 de enero del 1016, (Último acceso: 2/11/2017). Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/rcg/v31n1/v31n1a05.pdf